Rekayasa Genetika

   A.  Rekayasa Genetika
 

Domba Dolly

Rekayasa genetika atau manipulasi genetik adalah suatu upaya memanipulasi sifat makhluk hidup untuk menghasilkan makhluk hidup dengan sifat yang diinginkan. Memanipulasisifat genetik ini dilakukan dengan menambah atau mengurangi DNA. Menggabungkan dua DNA dari sumber yang berbeda dikenal sebagai rekombinasi DNA. DNA hasil rekombinasi dikenal sebagai DNA rekombinan.

Mengapa dalam rekayasa genetika digunakan DNA dalam menggabungkan sifat makhluk hidup? Hal tersebut karena DNA dari makhluk hidup apapun memiliki struktur yang sama, sehingga dapat direkombinasikan. Sedangkan penggabungan organ atau jaringanantar spesies untuk menghasilkan spesies baru mustahil dilakukan. Selanjutnya DNA inilah yang akan mengatur sifat-sifat makhluk hidup tersebut secara turun temurun. Dengan demikian mengubah sifat makhluk hidup dapat dilakukan dengan mengubah DNA yang dikandungnya.

Bagaimana cara mengubah DNA itu? Banyak cara dilakukan untuk mengubah DNA sel. Misalnya melalui persilangan, memberi sinar radioaktif, melakukan  transplantasi inti, melakukan fusi sel, dan melakukan rekombinasi DNA.

1.    Transplantasi inti

Transplantasi inti atau Transplantasi nukleus adalah memindahkan inti dari sel yang satu ke sel lain agar diperoleh individu baru yang mempunyai sifat baru sesuai dengan inti yang diterimanya. Penelitian tentang transplantasi inti dilakukan terhadap sel katak.inti sel yang dipindahkan adalah inti dari sel-sel usus katak, yakni inti yang memiliki 2n kromosom (diploid). Inti tersebut dimasukkan ke dalam ovum tanpa inti. Maka terbentuklah ovum dengan inti dari usus (berinti diploid)

Setelah ovum diberi inti baru, ovum membelah secara mitosis berkali-kali, menghasilkan bentukan seperti buah anggur yang disebut morula dan selanjutnya berkembang menjadi blastula. Selanjutnya blastula tersebut dipotong-potong (dikloning) menjadi banyak sel. Inti tiap sel tersebut diambil , kemudian dimasukkan ke dalam ovum tanpa inti yang lain. Maka terbentuklah ovum berinti diploid dalam jumlah banyak. Masing-masing ovum tersebut dikultur secara invitro sehingga berkembang menjadi individu baru. Individu yang terbentuk memiliki sifat yang sama. Peristiwa pembentukan individu baru tanpa proses perkawinan ini dikenal sebagai reproduksi paraseksual.

Kini Transplantasi inti dan penglonan sudah berhasil dicobakan pada tikus (mencit), dan pada domba di Inggris. Domba hasil kloning itu diberi nama Domba Dolly. Dan di jepang berhasil pula dikloning sapi

Klutur embrio mamalia harus dilakukan secara invivo. Ini disebabkan secara alami pertumbuhan embrio mamalia berlangsung di dalam uterus.

Dengan ditemukannya teknik pembekuan tubuh, maka embrio hasil kloning dapat disimpan dalam tabung bersuhu rendah sebelum ditanam di dalam uterus (rahim). Hal yang demikian pernah dilakukan pada sapi. Sebeleum embrio sapi ditanama di dalam uterus sapi terlebih dahulu disimpan dalam suhu rendah. Embrio yang disimpan dalam suhu rendah disebut embrio beku, yang dapat disimpan dalam waktu berbulan-bulan. Bila akan digunakan, embrio itu di ambil, suhunya dihangatkan kemudian dimasukkan ke dalam uterus sapi betina.

2.    Teknologi Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA berbentuk sirkuler yang terdapat di dalam sel bakteri atau ragi. Plasmid merupakan DNA kromosom, karena sel tersebut memiliki kromosom tersendiri. Jadi selain kromosom, di dalam sel terdapat pula plasmid. Plasmid memiliki sifat antara lain:

a.    Merupakan molekul DNA yang mengandung gen tertentu; ukurannya kira-kira 1/1000 kali kromosom (DNA) bakteri

b.    Dapat memperbanyak diri melalui proses replikasi. Dengan demikian terjadi kloning DNA yang menghasilkan plasmid dalam jumlah banyak. Dalam satu sel dapat berisi banayk plasmid.

c.    Plasmid dapat pindah ke sel bakteri lain. Perpindahan plasmid dapat di percepat dengan memberi ion C₅Cl (Cesium Clorida). Dengan demikian plasmid dapat dikeluarkan atau dimasukkan ke dalam sel bakteri atau ragi.

d.   Sifat plasmid pada keturunan bakteri sma dengan induknya, karena plasmid tidak terikat dengan kromosom inti.

Karena sifat-sifat itulah maka plasmid digunakan sebagai vektor, yaitu alat untuk memasukkan gen ke dalam sel target.

3.    Fusi Sel

Fusi sel artinya meleburkan dua sel baik dari spesies yang sama atau berbeda agar terbentuk sel bastar yang disebut hibridoma (hibrid=bastar, oma=sel kanker). Hibridoma itu memiliki sifat baru yang berasal dari sifat kedua sel asal. Disebut hibridoma karena pada mulanya sel yang difusikan adalah sel tertentu dengan sel kanker.

Sebenarnya, secara alami juga terdapat fusi sel, misalnya pada fertilisasi, yaitu saat sperma dan ovum melebur membentuk zigot. Demikian juga fusi sel terjadi ketika dua sel melakukan konjugasi.

Fusi sel didahului oleh peleburan mebran kedua sel diikuti oleh peleburan sitoplasma (disebut plasmogami) dan akhirnya terjadi peleburan inti sel (disebut kariogami)

a.    Proses fusi sel

Pada proses fusi sel buatan (invitro), diperlukan sel wadah, sel sumber gen, dan zat pemicu fusi sel yang dikanal sebagai fusigen.

1)   Sel wadah

Sel wadah atau sel target adalah sel yang memiliki sifat membelah cepat, agar dihasilkan hibridoma yang dapat dikultur dan membelah dengan cepat. Biasanya, yang digunakan sebagai sel wadah adalah sel mieloma. Sel mieloma adalah sel kanker, baiasany diambil dari tikus. Sel ini mampu membelah diri dengan cepat dan tidak membahayakan manusia.

2)   Sel sumber gen

Sel sumber gen adalah sel–sel yang memiliki sifat yang diinginkan, misalnya mampu memproduksi antibodi. Biasanya sel ini sulit dikultur sehingga perlu difusikan dengan sel mieloma. Sel penghasil antibodi yang ada di tubuh adalah sel limfosit B atau disebut sel B. Sel B diambil, dengan harapan jika difusikan akan menghasilkan hibridoma yang memiliki gen penghasil antibodi seperti induknya dan mampu membelah cepat seperti sel kanker.

3)   Fusigen

Fusigen adalah zat-zat yang mempercepat terjadinya fusi sel. Zat yang tergolong fusigen misalnya NaNO₃, C₅Cl⁺⁺, pH tinggi, polietilen glikol (PEG), medan listrik, dan virus.

b.    Manfaat fusi sel

Fusi sel dapat dimanfaatkan untuk berbagai keperluan, misalnya untuk pemetaan kromosom, menghasilkan antibodi monoklonal dan membentuk spesies baru.

1)   Pemetaan kromosom

Ketika terbentuk hibridoma, terjadi pengrusakan/ penghancuran kromosom secara acak. Ribuan sel wadah difusikan dengan ribuan sel  sumber gen, sehingga diperoleh ribuan hibridoma (sel C). Setiap sel hibridoma mengalami kerusakan kromosom yang tidak sama, sehingga sel hibridoma yang satu dan yang lain memiliki kromosom yang tidak sama pula.

Misalnya kromosom pada manusia diberi nomor pasangan 1 hingga 23. Setelah difusikan dihasilkan hibridoma. Sel hibridoma yang satu memiliki nomor 3, 5, 6, 11, 19, 23 sedang hibridoma yang lain memiliki kromosom nomor 11 dikultur (dibiakkan), kemudian produknya dianalisis, ternyata menghasilkan hormon insulin. Maka dapat disimpulkan bahwa gen insulin terletak pada kromosom nomor 11. Dengna teknik yang sama para ahli dapat memetakan kromosom, menunjukkan letak gen pada kromosom nomor tertentu.

2)   Pembuatan antibodi monoklonal

Antibodi adalah protein yang dihasilkan oleh sel limfosit B atau sel T guna melawan antigen (benda asing) yang masuk ke dalam tubuh. Secara alami tubuh mampu memproduksi antibodi. Antibodi tertentu hanya dapat melawan antigen tertentu pula. Antibodi yang dibentuk berupa klon sel limfosit yang disebut sebagai antibodi poliklonal.

Sel limfosit B dari hewan (tikus, kelinci, kuda, kera, atau lain) mampu menghasilkan antibodi. Dalam gambar nampak  sel B tikus diambil, setelah sel tikus diberi antigen (misal penyakit manusia). Sel B tikus difusikan dengan mieloma. Selanjutnya hibridoma dikembangbiakkan (dikloning, diseleksi untuk memperoleh satu hibridoma penghasil antibodi yang sesuai. Satu hibridoma tersebut dikultur agar diperoleh antibodi untuk manusia. Sebagian hibridoma dibekukan untuk cadangan.

Karena antibodi yang dihasilkan berasal dari pengklonan satu sel hibridoma, maka disebut sebagai antibodi monoklonal

3)   Pembentukan spesies baru

Fusi sel dapat digunakan untuk membentuk spesies baru yang tidak dapat dilakukan melalui persilangan.

Sel tumbuhan mempunyai dinding sel dari selulosa yang merupakan faktor penghalang terjadinya fusi sel, sehingga dinding sel tersebut harus dicerna. Caranya, sel tumbuhan diberi enzim selulase untuk menghancurkan dinding selnya. Maka tinggallah protoplasmanya, yang siap untuk difusikan. Karena itu fusi tumbuhan sering disebut sebagai fusi protoplas. Setelah difusikan, membran sel akan membentuk dinding sel baru sehingga terbentuk individu baru yang merupakan gabungan dari dua sel. Muncullah hibridoma yang diharapkan.

4.    Rekombinasi DNA

DNA dapat disambungkan dengan DNA lain dari sumber yang berbeda. Proses penyambungan DNA itu dikenal sebagai rekombinasi DNA. Sebenarnya tujuanya adalah untuk menyambungkan gen yang ada di dalamnya. Karena itu rekombinasi DNA disebut sebagai rekombinasi gen.

Dalam rekombinasi DNA dilakukan pemotongan dan penyambungan DNA. Proses pemotongan dan penyambungan DNA itu menggunakan enzim pemotong dan penyambung. Hasil sambungan DNA dikenal sebagai DNA rekombinan. Enzim pemotong disebut enzim restriksi endonuklease. Secara alami enzim ini dikeluarkan oleh bakteri untuk memutuskan DNA virus yang tersambung pada DNA bakteri, tanpa merusak DNA bakteri.

Secara alami rekombinasi DNA bisa terjadi. Misalnya jika terjadi proses pindah silang pada meiosis, akan terjadi tukar menukar kromatid pada kromosom yang homolog, sehingga DNA terputus dan tersambung secara silang. Contoh lainnya adalah pada proses transduksi. Transduksi adalah proses tersambungnya DNA bakteri yang satu dengan bakteri yang lain dengan perantara virus. Virus tersebut telah memasukkan DNA dari bakteri satu ke bakteri lain.

Contoh lainnya adalah transformasi. Transformasi terjadi jika ada bakteri A yang meindahkan materi genetiknya ke bakteri B yang sejenis di dekatnya. Bakteri B tersebut mendapatkan gen baru dari bakteri A.

Melihat kenyataan itu, para pakar pun mencoba untuk menyambung-nyambung DNA secara invitro dari sumber yang berbeda. Alasan dilakukannya rekombinasi adalah:

·      Semua DNA memiliki struktur yang sama yakni tersusun atas gula, asam fosfat, dan basa-basa nitrogen, yang teruntai membentuk polinukleotida.

·      Karena strukturnya sama, maka DNA dari sumber mana pun dan dari spesies apapun dapat disambung-sambungkan.

·      Para pakar telah berhasil mengisolasi atau mensintesis enzim.

·      Gen dapat mengekspresikan diri atau mengontrol sintesis polipeptida di manapun dia berada, asalkan dalam kondisi yang sesuai. Misalnya gen manusia dapat mengekspresikan diri meskipun berada di dalam sel bakteri.

a.    Yang diperlukan dalam rekombinasi DNA

               1)  Metode mendapatkan gen

Gen adalah sepenggal DNA yang mengontrol pembuatan polipeptida tertentu. Ukuran DNA sangat kecil sehingga untuk mendapatkannya diperlukan metode khusus. Beberapa literatur menyebutnya sebagai enzim penggunting atau enzim restriksi.

Memotong gen dari DNA secara keseluruhan itu dengan metode tembak langsung.

Selain itu gen juga dapat diperoleh dengan metode transkripsi balik yakni RNA dari suatu kelenjar ditranskripsi balik menjadi DNA dengan pertolongan enzim tertentu.

Cara yang lain untuk mendapatkan gen adalah dengan metode sintesis gen yaitu membuat gen secara invitro di laboratorium. Gen dibuat secara sintetik dengan urutan basa tertentu berdasar pada urutan asam amino protein yang dihasilkannya.

              2)  Enzim pemotong dan penyambung

Enzim pemotong dikenal sebagai enzim restriksi atau enzim penggunting. Nama umumnya enzim restriksi endonuklease. Fungsi enzim ini meotong-motong benang DNA yang panjang menjadi pendek-pendek agar dapat disambung-sambungkan kembali. Enzim pemotong secara alami dimiliki oleh sel guna proses pemotongan DNA dalam sel. Enzim pemotong itu jumlahnya banyak, dan yang telah dikenal mencapai 350an. Setiap enzim bekerja secara khusus. Artinya setiap enzim hanya dapat memotong urutan basa tertentu pada DNA. Hasil potongannya berupa sepenggal DNA berujung runcing yang komplemen.

Selain enzim pemotong restriksi endonuklease terdapat pula enzim penyambung yang berfungsi menyambung-nyambungkan DNA, yaitu enzim ligase. Enzim ligase DNA mengkatalisis ikatan fosfodiester antara dua rantai DNA. Ligase DNA tidak dapat menyambungkan DNA untai tunggal, melainkan harus DNA rangkap.

             3)  Pembawa gen atau vektor

Setelah diperoleh gen dan disambung-sambung, bagaimana memasukkan gen tersebut ke dalam sel target? Mengingat ukuran gen yang sangat kecil, maka memasukkan gen ke dalam sel target harus menggunakan pembawa gen atau vektor. Vektor itu bertugas sebagai “kendaraan” bagi gen untuk mengangkut gen masuk ke dalam sel target.

Dalam memilih vektor ini para ahli meniru kondisi alami. Secara alami, bakteri memiliki plasmid, yaitu DNA sirkuler yang ukurannya 1/1000 kromosom DNA bakteri, dan dapat keluar masuk sel bakteri. Jelasnya, plasmid dapat keluar dari sel bakteri yang satu dan masuk ke sel bakteri yang lain. Akibatnya bakteri yang lain tadi mendapatkan sifat baru yang berasal dari bakteri pertama. Peristiwa perubahan sifat ini dikenal sebagai transformasi.

Plasmid secara alami dapat keluar masuk sel sehingga dapat dimanfaatkan sebagai kendaraan bagi gen. Plasmid tersebut dapat disambung dengan gen terlebih dahulu, sehingga terbentuk DNA hasil sambungan yang disebut sebagai chimera (kimera) atau DNA rekombinan. Selanjutnya, kimera dimasukkan ke dalam sel target yaitu ke sel bakteri. Maka sel target akan mendapatkan sifat baru sesuai gen yang diterimanya.

Karena kimera tersebut berupa DNA, maka sesuai dengan sifatnya akan mengadakan replikasi di dalam sel inangnya, sehingga jumlahnya bertambah banyak. Dengan demikian berlangsunglah proses pengklonan DNA. Ketika kimera melakukan replikasi, gen yang dibawanya akan ikut tereplikasi, sehingga terjadilah kloning gen.

             4)  Sel target

Sel target yang biasa digunakan dalam rekombinasi adalah sel bakteri Escherichia coli, karena:

a)    E.coli mudah diperoleh dan mudah dipelihara

b)    Tidak mengandung gen yang membahayakan (tidak ganas)

c)    Tidak membelah diri setiap 20 menit sekali, sehingga dapat diperoleh keturunan dengan jumlah besar dalam waktu singkat.ini juga berarti produknya dapat dipanen secara cepat.

b.    Proses rekombinasi

Contoh rekombinasi berikut ini merupakan peristiwa rekombinasi yang telah berhasil dilakukan oleh para pakar, yaitu rekombinasi gen insulin. Gen insulin adalah gen manusia yang mengontrol oembuatan insulin. Kelainan pada gen ini menyebabkan penderita kekurangan insulin dan akibatnya akan menderita diabetes melitus.

Dulu, penderita diabetes malitus diobati dengan memberi suntikan insulin sapi atau babi. Semakin banyak penderita, semakin banyak sapi dan babi yang tersedia guna diambil insulinnya. Selain itu, insulin sapi dan babi tidak cocok dengan manusia karena ada beberapa asam amino dari insulin sapi atau babi yang tidak sama dengan insulin manusia. Tubuh penderita menolak insulin sapi atau babi itu karena tidak sesuai. Artinya, penderita diabetes hanya aman jika disuntik dengan insulin manusia. Persoalannya adalah, bagaimana cara mendapatkan insulin manusia? Tidak mungkin dengan mengambil dari manusia lain bukan?

Gen insulin dari manusia pulai Langerhans di ginjal diambil, kemudian disambungkan ke dalam plasmid bakteri, membentuk kimera. Kimera itu dimasukkan ke dalam sel target E.coli. bakteri E.coli ini dikultur, untuk dikembangbiakkan. Ternyata bakteri yang biasa hidup di kolon itu mampu memnghasilkan hormon insulin manusia. Hormon insulin tersebut dipanen untuk dijual kepada mereka yang memerlukannya. Maka sekali terbentuk bakteri rekombinan penghasil insulin manusia, selamanya akan dapat dipanen insulin untuk pengobatan.

Tidak hanya insulin manusia yang berhasil diproduksi oleh bakteri, malinkan juga hormon pertumbuhan manusia. Para pakar berhasil “mencangkokkan” gen hormon pertumbuhan manusia ke dalam sel bakteri dan akhirnya bakteri itulah yang memproduksi hormon pertumbuhan manusia. Hormon ini disuntikkan ke orang-orang yang mengalami kekerdilan akibat kurangnya produksi hormon pertumbuhan di tubuhnya.

  B.  Preparasi Fragmen DNA

Keanekaragaman genetika bakteri tercermin dalam besarnya rentang enzim restriksi. Fungsi enzim restriksi belum sepenuhnya diketahui; sebagian mungkin melindungi inangnya dengan memecah DNA asing yang mungkin dimasukkan oleh virus: enzim dapat membedakan DNA inang, yang terlindung dari efek pemotongan, dan DNA asing, yang akan dipotong. Sesuai dengan fungsi ini, enzim restriksi memiliki kemampuan memilih luar biasa yang memungkinkannya mengenal urutan (sekuens) DNA khusus yang akan dipotong. Urutan DNA yang akan dikenal oleh enzim restriksi terutama adalah palindrom (inversi ulang urutan basa). Palindrom urut yang dikenal oleh enzim restriksi (yang sering digunakan) EcoR1, adalah GAATTC; ulangan yang terbalik, sesuai dengan komplementaritas pasangan-basa G––C dan A––T, menghasilkan urutan 5’ TTC yang tercermin sebagai AAG dalam untai 3’.

Panjang fragmen DNA yang dihasilkan oleh enzim restriksi sangat beragam karena individualitas urutan DNA. Panjang rerata fragmen DNA sebagian besar ditentukan oleh jumlah basa khusus yang dikenal oleh suatu enzim. Umumnya enzim restriksi mengenal empat, enam, atau delapan urutan basa. Pengenalan empat urutan basa menghasilkan fragmen dengan panjang rerata sebesar 250 pasang basa, dan karena itu biasanya berguna untuk analisis atau manipulasi fragmen gen. Gen lengkap sering diliputi oleh enzim restriksi yang mengenal enam basa dan menghasilkan fragmen dengan ukuran rerata sekitar 4000 pasangan basa. Enzim restriksi yang mengenal delapan basa menghasilkan fragmen dengan ukuran khas 64.000 pasangan basa dan berguna untuk analisis daerah genetik yang luas.

  C.  Pemisahan Secara Fisik Fragmen DNA

Dasar sederhana yang melandasi teknik rekayasa genetik ialah fakta bahwa elektroforesis gel memungkinkan fargmen DNA dipisah berdasarkan ukurannya: semakin kecil ukuran fragmen, semakin cepat laju migrasinya. Laju migrasi keseluruhan dan rentang ukuran optimal untuk pemisahan ditentukan oleh sifat kimia gel dan derajat penautan–silangnya. Gel dengan banyak tautan-silang baik untuk pemisahan fragmen-fragmen DNA yang kecil. Zat warna etidium bromida membentuk suatu produk reaksi (adduct) yang berflouresen terang sewaktu berikatan dengan DNA, sehingga fragmen DNA berukuran kecil yang dipisahkan dapat dipotret pada gel. Fragmen DNA khusus dapat dikenali dengan pelacak yang mengandung urutan komplementer.

Elektroforesis pulsa memungkinkan pemisahan fragmen DNA yang mengandung sampai  100.000 pasingan basa  (100 kilobase pair [kbp]). Sifat-sifat khas dari fragmen-fragmen besar menghasilkan konstruksi peta fisik untuk kromosom dari beberapa spesies bakteri. Pada satu penelitian, telah diperlihatkan bahwa gen-gen bakteri diatur dalam dua kromosom yang terpisah.

  D.  Karakterisasi DNA Klon

1.    Pemetaan Restriksi

Untuk manipulasi DNA klon dibutuhkan pengertian mengenai strukturnya. Penyiapan peta restriksi merupakan langkah pertama dalam memperoleh pengertian ini. Suatu peta restriksi dibuat mirip dengan cara menyatukan teka-teki potongan gambar terhadap berbagai ukuran fragmen yang dihasilkan oleh cernaan tunggal (single digest), yang diperoleh dengan pemotongan enzim restriksi tunggal, dan oleh cernaan ganda (double digest), yang dibentuk oleh pasangan enzim restriksi. Peta restriksi juga merupakan langkah awal untuk pengurutan DNA, karena peta ini dapat mengenali fragmen yang akan memberikan subklon (fragmen DNA berukuran relatif kecil) yang dapat dianalisis dengan lebih teliti, yang melibatkan pengurutan DNA. Selain itu, peta restriksi memberikan dasar informasi yang sangat khusus yang memungkinkan fragmen DNA, yang dikenali berdasarkan ukuran, dihubungkan dengan fungsi gen khusus.

2.    Pengurutan

Pengurutan DNA menunjukkan struktur gen dan memungkinkan peneliti menyimpulkan struktur produk-produk gen. Pada gilirannya, informasi ini memungkinkan gen untuk dimanipulasi agar dapat dipahami atau diubah fungsinya. Selain itu, analisis urutan DNA dapat mengungkapkan daerah pengaturan yang mengendalikan eskpresi gen dan tempat –tempat yang rentan terhadap mutasi (hot spot). Perbandingan urutan DNA mengungkapkan hubungan evolusi yang menjadi dasar klasifikasi yang tidak meragukan lagi bagi berbagai organisme dan virus. Perbandingan ini juga dapat memudahkan pengenalan daerah lestari yang terbukti amat berguna sebagai pelacak hibridasi khusus untuk mendeteksi organisme atau virus dalam contoh klinis.

Kedua teknik ini menghasilkan aliran ologonuleotida yang berasal dari sumber tunggal, dan memerlukan pemisahan pada suatu gel pengurut untai-untai DNA yang dapat membedakan adanya satu ukuran nukleotida. Gel pengurut dapat memisahkan untai dengan panjang yang berbeda, mulai dari satu hingga beberapa ratus nulkeotida, dan mengungkapkan urutan DNA dengan berbagai ukuran. Suatu urutan ditunjukkan dengan melakukan reaksi campuran yang sama dalam empat jalur sejajar, urutan keseluruhan masing-masing mengungkapkan suatu nukleotida khusus.

Contohnya, pengakhiran perpanjangan dengan memasukkan 2’,3’-deoksiadenin-5’-fosfat dapat mengungkapkan panjang relatif suatu untai yang mengandung adenin pada posisi yang diakhiri. Serangkaian untai semacam itu, yang masing-masing diakhiri pada posisi yang berbead, dibuat dengan memasukkan beberapa dideoksinukleotida dalam campuran reaksi polimerase DNA.

Empat lajur sejajar pada gel yang sama mengungkapkan panjang relatif dari untai yang mengalami terminasi dideoksi pada adenin, sitidin, guanidin, dan timidin. Perbandingan keempat lajur yang mengandung campuran reaksi yang berbeda dalam metode pengakhiran rantai memungkinkan untuk menentukan urutan DNA pada metode Sanger.

Karena metode Sanger relatif sederhana, metode ini lebih umum digunakan, tetapi teknik Maxam-Gilbert dipakai secara luas karena menunjukkan daerah DNA yang dilindungi oleh protein pengikat khusus terhadap modifikasi kimia.

Pengurutan DNA dipermudah dengan manipulasi genetik pada bakteriofaga M13 (bakteriofaga E coli), yang mempunyai DNA beruntai-tunggal. Bentuk replikatif DNA faga adalah DNA lingkar untai-ganda yang tertutup secara kovalen dan telah direkayasa sehingga mengandung tempat kloning majemuk yang memungkinkan integrasi fragmen DNA khusus yang sebelumnya telah dikenali dengan pemetaan restriksi. Bakteri yang diinfeksi oleh bentuk replikatif mengeluarkan modifikasi faga berisi DNA untai-tunggal yang mencakup urutan sisipan pada lapisan protein luarnya. DNA ini bertindak sebagai cetakan (template) untuk reaksi pemanjangan. Titik awal pemanjangan ditentukan oleh primer DNA, yang dapat disintesis dengan peralatan otomatis untuk sintesis oligonukleotida secara kimiawi. Mesin tersebut, yang dapat menghasilkan untai DNA berisi 75 oligonukleotida atau lebih dalam suatu urutan yang sudah ditentukan, sangat berguna dalam pengurutan dan modifikasi DNA dengan metode mutagenesis terarah.

Oligonukleotida yang disintesis secara kimiawi dapat dianggap sebagai bentuk primer dalam reaksi rantai polimerase (polymerase chain reaction PCR), yaitu suatu prosedur yang menghasilkan pengerasan dan pengurutan DNA yang terletak di antara oligonukleotida. Dengan demikian, di banyak penelitian, DNA tidak perlu diklon lagi untuk diurutkan atau disiapkan bagi rekayasa.

  E.  Mutagenesis Berdasarkan Lokasi

Sintesis oligonukleotida secara kimiawi memungkinkan peneliti untuk melakukan substitusi basa secara terkendali ke dalam suatu urutan DNA. Substitusi tertentu dapat digunakan untuk mempelajari efek mutasi (yang telah dirancang sebelumnya) pada ekspresi gen, utuk memeriksa peran asam amino yang diganti dalam fungsi protein, atau- berdasarkan informasi mengenai residu yang penting untuk fungsi- untuk menonaktifkan suatu gen. Oligonukleotida beruntai-tunggal yang mengandung mutasi khusus disintesis secara kimia dan dihibridasikan dengan DNA bakteriofaga beruntai-tunggal, yang membawa urutan tipe normal sebagai sisipan. DNA yang dihasilkan sebagian beruntai-ganda, diubah secara enzimatik menjadi bentuk replikatif yang sepenuhnya beruntai-ganda. DNA ini, yang mengandung urutan tipe normal pada satu untai, dan urutan mutan pada untai yang lain, digunakan untuk menginfeksi bakteri inang melalui transformasi. Replikasi akan mengakibatkan pemisahan DNA tipe normal dari DNA mutan, dan gen mutan untai-ganda dapat diisolasi kemudian diklon dari bentuk replikatif faga.

Sintesis oligonukleotida secara kimiawi memungkinkan pembentukan gen sintesis yang mengandung tempat restriksi yang tersebar luas, sehingga dapat terjadi penggantian secara moduler urutan DNA yang menyandikan protein mutan. Mutasi ganda dapat dengan mudah dimasukkan. Pada dasarnya, suatu sifat yang dikehendaki (misalnya antigenisitas) dapat dipertahankan, sementara sifat yang tak dikehendaki (misalnya toksisitas) dapat dihilangkan. 

Pustaka

Geo. F. Brooks, Janet S. Butel, L. Nicholas Ornston. 1996. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 20. Jakarta: EGC

Syamsuri, Istamar. 2000. Biologi 2000 Jilid 3B untuk SMU Kelas 3. Jakarta: Erlangga